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瑞士步琦
使用SFC分离西红花主要提取物
SFC应用
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简介
西红花是世界上最昂贵的香料。虽然西红花植物的花有一种精致的紫色色调，但它的丝状红色柱头是高度珍贵的，因为它可以用作香料和天然染料。在秋天，柱头被手工采摘并分离，以产生独特的红色香料。生产一磅（0.45公斤）的西红花需要7万朵花。
西红花素、西红花素的糖苷衍生物和微西红花素是西红花的颜色和味道的化合物。Safranal，一种单萜醛，也存在。此外，西红花中还有一些化合物具有公认的药理活性，如西红花素衍生物和类黄酮。例如，西红花类胡萝卜素已被提出作为抗肿瘤的替代药物，在将来可能单独或与其他化合物联合治疗某些癌症。
因此，有许多出版物在处理提取和分析西红花的文献。通常采用反相液相色谱（RP-LC）分离。典型的溶剂是水/乙腈或水/甲醇混合物。同往常一样，固定相为C18。初始分离条件为高含水量，使用梯度法使有机溶剂含量随时间显著增加，以洗脱非极性化合物。甲酸常加到流动相中。
超临界流体色谱（SFC）是一种使用超临界二氧化碳（CO2）作为流动相的色谱方法。超临界二氧化碳具有较高的扩散系数和较低的粘度，是分离和分析化合物的优良溶剂。与其他类型的色谱法相比，SFC 提供了几个优点，包括更快的分析时间，更低的溶剂使用量和不同的选择性。与 RP-LC 相比，SFC 是一种正交技术。
本应用说明介绍了用 SFC 和质谱联用分离西红花螺纹主要成分的方法。分析物的电离是通过电子喷雾电离（ESI）进行的。由于流动相由于使用 CO2 和甲醇而具有微酸性，因此不需要使用添加剂。
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设备
Sepiatec SFC Instrument
Advion CMS detector
Nucleodur NH2 5 μm 250 x 4 mm
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试剂和材料
二氧化碳（99.9%）
甲醇（≥99%）
西红花线
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实验流程
样品制备：
1000mg 西红花用 10mL 热甲醇提取 5 次。最终溶液经过过滤，用于天然化合物的分离。
实验条件：
移动相 | A =二氧化碳；B =甲醇 |
移动相条件 | 0 - 1分钟：14% B |
1 - 18分钟 | 14 - 18% B |
18 - 40分钟 | 18 - 50% B |
40 - 44分钟 | 50% B |
检测 | UV 440 nm MS ESI （+/-） |
在 86/14% 的超临界二氧化碳和甲醇条件下，以 7 mL/min 的流速对 Nucleodur NH2 5 μm 250 × 4 mm 进行 5min 的平衡。使用自动进样器进样（V = 100 uL），开始运行（运行时间 =44 min）。背压调节器设置为 150bar，柱箱加热至 40°C。
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实验结果和讨论
▲ 图1. 西红花提取物纯化后紫外色谱图（紫外波长440 nm）
用甲醇对西红花的主要成分进行了提取。由于甲醇是一种极性溶剂，因此会溶解一些极性化合物。图1为 440 nm 处的紫外色谱图。在前18分钟，由于流动相（86 - 82% CO2）的非极性特性，没有紫外线活性化合物洗脱。当流动相的极性通过梯度增加时，几种极性化合物被洗脱。由于紫外检测不允许对成分进行鉴定，因此SFC与MS耦合，可以连续鉴定。图2为紫外和质谱图。MS信号基于不同的质量：(b) mass 999 – 999.5 (ESI+); (c) mass 836.9 – 837.4 (ESI+); (d) mass 674.8 – 675.3 (ESI+); (e) mass 975.5 – 976 (ESI-); (f) mass 813.4 – 813.9 (ESI-); (g) mass 651.4 – 651.9 (ESI-) and (h) mass 341.2 – 341.7 (ESI-).
▲ 图2. (a) UV- and (b – h) MS-Chromatograms of the purification of saffron extract; (b) mass 999 – 999.5 (ESI+); (c) mass 836.9 – 837.4 (ESI+); (d) mass 674.8 – 675.3 (ESI+); (e) mass 975.5 – 976 (ESI-); (f) mass 813.4 – 813.9 (ESI-); (g) mass 651.4 – 651.9 (ESI-) and (h) mass 341.2 – 341.7 (ESI-)
表1 为 图2 中经质谱鉴定的主要化合物。在质谱分析中使用 ESI 电离分子，这是一种常压下的温和电离方法。电离可以在正电压（ESI+）或负电压（ESI-）下进行。在正离子模式下，通常会形成钠加合物（[M+Na]+）或质子加合物（[M+H]+）。在负离子模式下，（[M-H]-）离子通常是由于失去一个质子而形成的。根据样品及其性质的不同，也可以形成多种带电产物。
西红花素与几种糖（葡萄糖、龙胆二糖、三甘糖和新波糖苷）结合形成西红花素。西红花素与糖分子的共价键导致极性的强烈增加，并使西红花素具有亲水性，这就是为什么在 AN 洗脱液中鉴定出的主要成分较晚。从 表1 中可以看出，西红花丝线中存在西红花素与龙胆糖和葡萄糖结合的情况。
复合克罗辛二硫代糖酯是由克罗辛和两个龙胆糖分子组成的，这两个分子是由 2 个 d -葡萄糖分子构建而成的。在 图2 (b) 中，化合物被鉴定为正离子质量为 999 - 999.5。该加合物由钠（质量 23g/mol）和样品分子（质量 976.4g/mol）组成。对应的谱图如 图3 (a) 所示。在负电离电压下也可以检测到番薯素二糖糖酯（图2 (e) 质量 975.5 - 976），对应的质谱图如 图3（b）所示。
在 ESI+ 模式（图2(c)）和 ESI- 模式（图2(f)）下，西红花素根生物基糖基酯分别为（[M+Na]+ 质量 836.9 ~ 837.4）和（[M- h]- 质量 813.4 ~ 813.9）。对应的质谱图如 图3 (c) 和 (d) 所示。复方西红花素-龙胆生物基糖基酯由西红花素、龙胆糖和d -葡萄糖分子组成。
在 ESI+ 模式（图2(d)）和 ESI- 模式（图2(g)）下，西红花素 gentiobiosyl 酯分别为（[M + Na]+ 质量 674.8 - 675.3）和（[M - H]- 质量 651.4 - 651.9）。对应的质谱如 图3 (e) 和 (f) 所示。Crocetin 甲酯只能在 ESI- 模式下识别 (图2（h) 质量 341.2 - 341.7 和 图3(g)）。
在 ESI 过程中，样品分子也是碎片化的，这就是为什么在图2中，一些西红花被分配到多个质量。例如，番石榴素二硫代糖酯可以电离成加合物（[M + Na]+）或（[M - H]-），但也可以进一步破碎。在负离子过程中，葡萄糖基团的去除导致片段的质量与西红花素根生物基糖基酯和西红花素根生物基酯相似。
▲ 表1. 质谱法鉴定的西红花丝线主要成分的结构和分子量（图2）。
化合物 1 在 ESI+ 和 ESI- 两种模式下均进行了质量定向分馏，而化合物 2 只在 ESI+ 模式下进行了质量定向分馏。化合物 4 只能在 ESI- 模式下采集。然而，化合物 No.3 的提取质谱由于存在与化合物 No.1 和 2 结构相似的片段而变得复杂，从而干扰了质量导向分馏过程。为了解决这个问题，采用了一个额外的时间窗口。
▲ 图3. 西红花素二糖糖酯(a) ESI+和(b) ESI-，西红花素根生物基糖基酯(c) ESI+和(d) ESI-，西红花素根生物基酯(a) ESI+和(b) ESI-和(g)西红花素甲酯ESI-的质谱
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实验结论
在分析天然产物时，未知产物往往在提取过程中溶解。为了识别这些未知的成分，需要质谱分析。本研究采用甲醇提取西红花线的主要成分，并采用 SFC-UV/MS 对其进行分析。用质谱法对其主要成分进行了连续鉴定。
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